高分辨率熔解曲线（HRM）原理及应用(转载)
高分辨率熔解曲线分析（high resolution melting analysis，HRM）的基本原理：双链核苷酸（double strand DNA，dsDNA）的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中 dsDNA 解链行为的改变。
因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到dsDNA 上，因此利用实时 PCR 技术，通过实时检测 dsDNA 熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将 PCR 产物中存在的差异直观地展示出来。
同时，借助于专业性的分析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。
HRM原理：
在PCR反应前将新型DNA饱和荧光染料加入反应体系，然后将PCR产物直接导入高分辨熔解分析仪中，在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行加热变性，仪器的光学检测系统采集、分析荧光信号并绘制温度熔解曲线，根据不同熔解曲线形状来区分（单个）碱基差异。
最广泛的 HRM 分析应用领域是基因筛查。基因筛查是搜索 PCR 扩增片段中是否存在未知变异，它可在测序步骤之前进行或者作为替代测序方法。由于 PCR 产物突变可导致 DNA 熔解曲线的形状改变，因此它可以利用 HRM分析检测。杂交双链 DNA 样本扩增并熔解时，其熔解曲线不同于纯合野生型或突变样本。如果操作得当，可以减少至少95%的测序工作量。随着DNA染料和分析仪器的发展，HRM技术还将继续完善和改进，在遗传病分子诊断领域发挥更多的作用。
HRM应用：
• 基因筛查 (突变研究)• 杂合性研究• 突变分析• 物种鉴定• 单核苷酸多态性 (SNP) 检测• 甲基化分析
这边艾美捷推荐5X热启动EvaGreen高分辨率熔解曲线分析-预混Mix（PCR） 08-31-00001
发表文章实验结果展示：
【1】Negrisolo, Susanna et al. “Could the interaction between LMX1B and PAX2 influence the severity of renal symptoms?”European Journal of Human Genetics26 (2018): 1708-1712.
使用Solis试剂盒，分析PAX2基因4号外显子的错义突变
【2】Gaczkowska, Agnieszka, et al. “Association of CDKAL1 Nucleotide Variants with the Risk of Non-Syndromic Cleft Lip with or without Cleft Palate.”Journal of Human Genetics, vol. 63, no. 4, 2018, pp. 397–406.
使用Solis试剂盒，分析CDKAL1基因SNP
HRM分析成功的关键：
1.保持较短的扩增片段，实现最高的灵敏度。与较大的扩增片段相比，100 bp 左右的扩增片段可简化单核苷酸熔解曲线的检测。
2.确保 PCR 扩增片段的特异性。错配产物和引物二聚体可使数据解释复杂化。引物浓度低于 200nM，MgCl2 在 1.5 mM至3 mM 范围及使用热启动DNA 聚合酶将有助于获得高特异性。
3.确保反应使用足够的模板。一般而言，Ct 应低于30，以生成足够的材料，实现准确的熔解分析。
